Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction..

Writer : ডা. কাওসার, ঢামেক, কে-৬৫

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

• DNA থেকে RNA তৈরিঃ Transcription
• RNA থেকে DNA তৈরিঃ Reverse Transcription

সন্দেহভাজন রোগীর সামান্য Sample নিলাম, যেখানে হয়তো সামান্য SARS-CoV-2 আছে, আছে তার সামান্য RNA – যেহেতু এটি একটি RNA ভাইরাস। এই সামান্য RNA কে Machine Read করবে না, তাই পরিমাণ বাড়াতে হবে।

DNA ভাইরাস হলে শুধু PCR করলেই হতো।

DNA থেকে DNA তৈরিঃ Replication

অর্থাৎ একটি (Monomer) DNA থেকে অনেকগুলো (Polymer) DNA তৈরি হয়ঃ Polymerase Reaction, এই Reaction পরমাণুর ফিশন বিক্রিয়ার মত বাড়তেই থাকেঃ তাই এটি একটি Chain Reaction

এই Reaction তো আর এমনি এমনি হবে না, এতে কিছু অনুঘটক (Enzyme) লাগবেঃ DNA Polymerase enzyme

তাই RT PCR হলঃ

• প্রথমে viral RNA কে Reverse করে DNA বানানো,
• তারপর সেই DNA থেকে Replication করে অসংখ্য DNA বানানো,
• এই অসংখ্য DNA কে মেশিন সহজে এখন Read করতে পারবে, তারপর সে Result দিবে।

★ এবার বিস্তারিত বর্ননা!

SARS-COV-2 এর RNA,

এর সাথে Reverse Transcriptase enzyme যোগ করা হল,

RNA থেকে তৈরি হল complimentary বা cDNA. (complementary – কারণ এটা এই ভাইরাসের DNA না, যেহেতু এটি RNA ভাইরাস)। এটা হল First Step.

Second Step এ cDNA এর সাথে নিচের জিনিসগুলো মিশানো হয়।

২ টা Step মিলে এটাকে 2 Step RT PCR বলা হয়। আর যদি সবকিছু একবারে একসাথে মিশিয়ে কাজ করা হয়, তবে সেটাকে বলে 1 Step RT PCR.

যাই হোক, cDNA এর সাথে যা যা মিশানো হয়,

• ১. এক প্রকারের oligonucleotide, যার নাম দিলাম X. বাইরে থেকে যোগ করা এই oligonucleotide কে synthetic short DNA primer ও বলা হয়।
• ২. Thermostable DNA polymerase এনজাইম।

SARS-CoV-2 এর RNA থেকে যে cDNA তৈরি করা হলো, স্বাভাবিক নিয়মে তার ২ টা Helix. আমাদের উদ্দেশ্য ২ টা Helix থেকে ২ টা cDNA, ২ টা cDNA ভেঙে ৪ টা Helix, যেটা থেকে থেকে ৪ টা cDNA, এভাবে সংখ্যা বৃদ্ধি করা।

এটা করতে গেলে cDNA কে ভেঙে প্রথমে ২ টা Helix এ আলাদা করতে হবে। এটা করা হয় তাপ দিয়ে। 94-95°C তাপমাত্রায় cDNA ভেঙে ২ টা Helix হয়ে যায়। এই তাপে এখানেই থাকা DNA polymerase এনজাইম যেন নষ্ট না হয় তাই thermostable DNA polymerase এনজাইম ব্যবহার করা হয়।

এই যে ২ টি আলাদা Helix হল, তার প্রতিটিতে অসংখ্য oligonucleotide প্রান্ত আছে, সেগুলোর নাম দিলাম A, B, C, D ইত্যাদি।

oligonucleotide এর প্রতিটি nucleotide এ আলাদা আলাদা nitrogen base আছে যা নির্দিষ্ট nitrogen base এর সাথে hydrogen bond এর মাধ্যমে যুক্ত হয়।

মনে আছে নিশ্চয় Second Step এ এক প্রকারের synthetic short DNA primer যোগ করেছিলাম, যার নাম দিয়েছিলাম X.

ধরে নিই, এই X তার ধরণ অনুযায়ী double Helix cDNA এ থেকে যে single Helix তৈরি করা হল – সেটার যে উন্মুক্ত A, B, C, D প্রান্ত আছে তার A প্রান্তের সাথে যুক্ত হবে। মনে রাখতে হবে, তাপ দিয়ে যেমন double Helix কে ভেঙে single Helix করেছি, এখন ঠান্ডা করে এই single Helix এর সাথে primer যুক্ত করতে হবে। মেশিনের মূল কাজ হল alternately এই গরম-ঠান্ডা তাপমাত্রা তৈরি করা।

ফাইনালি তৈরি হল A-X double Helix (viral A + synthetic X). অর্থাৎ ২ টি synthetic X oligonucleotide primer খরচ হয়ে ১ টি cDNA ২ টি Helix থেকে তৈরি হল ২ টি A-X double Helix cDNA. এই Replication Reaction এ সাহায্য করবে thermostable DNA polymerase এনজাইম। আর এভাবেই synthetic primer খরচ হয়ে ১ টি থেকে ২ টি, ২ টি থেকে ৪ টি, এভাবে অসংখ্য cDNA তৈরি হবে।

যখন যথেষ্ট পরিমাণ cDNA তৈরি হবে, যার মধ্যে আছে synthetic primers – সেগুলো তখন fluorescence সিগনাল পাঠাবে, কম্পিউটার সেই সিগনাল Read করবে, Result হবে SARS-CoV-2 পজিটিভ।

কম্পিউটারে চোখের সামনে real time এ এই positive signal দেখা যায়, তাই তখন তাকে real time RT PCR বলে। এ ছাড়া আরো কিছু RT PCR আছে, যেমন relative, comparative, competitive, etc.

কিন্তু স্যাম্পলে যদি এই viral RNA না থাকে তবে উপরের কিছুই আর ঘটবে না, অর্থাৎ SARS-CoV-2 নেগেটিভ।

বিস্তারিত বিষয়টির যথাসম্ভব শর্টকাট।

Edited By : Nahid Hassan.